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- 介绍：
基 因 型MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATA AUR1-C MEL1简 要 说 明Y2HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。Y2HGold -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子（G1，G2，M1）启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。High5TM系列Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。操 作 说 明1.取1管感受态细胞置冰上融化，6 000 rpm离心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重悬细胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重复一次)，预冷目的质粒2-5ug,体积不多于20ul。3.充分混匀，于30度250 rpm转速下培养30 min。4.42度热激2.5min。5.6000 rpm离心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，温和重悬细胞。7.6000 rpm离心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重悬细胞，将细胞涂布于相应的营养缺陷型固体合成培养基。9.30度倒置培养48-96h，直至形成大小合适的酵母菌落。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone 20gyeast extract 10g 0.2% adenine 15ml补水到 950ml， 用盐酸调PH到 6.5Agar 20g (for plates only)121度，15分钟高压灭菌， 待培养基温度降到55度时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml 0.2% adenine(1L)Adenine 2g补水 到1L， 溶解后高压灭菌或0.22um 滤膜过滤除菌注 意 事 项1. 感受态细胞最好在冰上融化。2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。4.Y2HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y2HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。
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- 储存条件： -80℃
- 用途： 酵母感受态细胞
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质量 (mg) = 浓度 (mM) x 体积 (mL) x 分子摩尔量 (g/mol)
