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- 介绍：
BL21 是最早开发的用于原核表达的菌株，BL21（DE3）、Rosetta、OrigamiB(DE3) 等一系列原核表达菌株均来源于 BL21 菌株。该菌株主要用于非毒性蛋白的表达，不含 T7 RNA 聚合酶，所以不能用于由 T7 启动子驱动的蛋白表达(如：pET 系列)；但含有大肠杆菌 RNA 聚合酶，可以用于 tac 或 trc 等使用大肠杆菌 RNA 聚合酶的原核系统的表达（如：pGEX，pMAL 质粒）。AngYuBio High5 TM 系列 BL21 电击感受态细胞由特殊工艺制作，经 pUC19 质粒检测转化效率达 10 9 cfu/μg。
- 操作说明
- 1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。
- 2. 取-80℃保存的 BL21 电击感受态细胞插入冰中 5 分钟，待其融化，加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手拨打 EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
- A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；
- B. 对盐浓度较高的 DNA 溶液或反应体系请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，然后与电击感受态混合进行电击转化。
- 3. 用 200 μl 枪头(用刀切除 0.5cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
- 4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
- 5. 2 分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入 700 μl 不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基（室温），用 1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到 50 ml 离心管（BD Falcon 50 ml 锥形离心管等），向离心管中补加 S.O.C. 培养基至 10 ml。37℃，225 rpm 复苏 60 分钟。
- 6. 5000 rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养 13-17 小时。
- 注意事项
- 1. 加入 DNA 时体积不应大于感受态体积的 1/10。
- 2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
- 3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
- 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
- 5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
- 6. 加入 DNA 浓度不能过高，最好不超过 100 ng/μl。过高浓度质粒会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
- 7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
- 8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
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- 储存条件： -80℃
- 用途： 表达感受态细胞
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本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (mg) = 浓度 (mM) x 体积 (mL) x 分子量 (g/mol)
