
凝胶电泳是我们基本的分子实验。其基本原理是电泳分子在电场作用下移动,因此它同电场的强度、电泳分子本身所带的净电荷数成正比。由于在电泳中使用了无反应活性的稳定的支持介质,从而降低了对流运动,故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比的。目前实验室中常用的琼脂糖凝胶电泳染料有EB、GeneFinderTM、GoldViewTM、SybrGreenI、GelRed和GelGreen。
下面对这几种核酸染料一一进行分析
1、溴化乙锭(EB)由于其价格便宜、使用方便已成为常用的核酸染料,被广泛应用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA或RNA。然而EB是一种强诱变剂,具有中等毒性,对皮肤、眼睛、口腔和上呼吸道系统有刺激性作用,对人体有潜在危害性,且废弃的EB染液易污染环境。EB本身在紫外下不发光,与单链、双链或三链DNA结合后发出明亮的荧光,EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂,且具有潜在的诱变作用。EB的使用方法简单,可在制胶时将其加入进行前染,也可在电泳结束后进行后染。前染有利于节约时间,但易出现条带变形拖尾等问题;后染较费时,但效果较好。
2、绿色荧光核酸染料是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型DNA染料,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光,而单链DNA呈红色荧光。
3、GoldViewTM也是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料,采用琼脂糖电泳检测DNA时,GoldViewTM与核酸结合后能产生很强的荧光信号,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。GoldView对于大片段DNA的染色效果较好,但对于500 bp以下的片段效果并不理想,而且它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭,一般约5-10 min条带就会消失,所以应尽快拍照、观察。另外,GoldView灵敏度差、本底色严重,不适用于切胶回收,且其毒性较大,尤其在紫外灯下,其诱导突变能力极高。
4、SybrGreen I也是一种常用的核酸染料,它与双链DNA(dsDNA)结合后,荧光大大增强,检测的灵敏度也高于EB。在紫外照射透视下,与双链DNA结合的SybrGreen I呈现明亮的绿色荧光,但其稳定性较差(怕光、怕热),使得染色的重复性较低。它对于50 bp以下的DNA片段染色能力缺失,对小于100 bp的DNA片段检测灵敏度也较低。SybrGreen I的使用同样简单,致变性也比EB低,但仍然不能保证实验者的安全性,同时其高昂的价格也限制了它的广泛使用。
5、GelRed 和 GelGreen是集高灵敏、安全和高稳定性于一身的极佳荧光核酸染料。其通过美国环保局安全认定,废弃物可直接倒入下水道,不会造成任何环境污染。GelRed为配合紫外凝胶成像系统而设计,使用方法与EB一样极其方便简单,在预制凝胶中使用时仍有极高的灵敏度,对小分子量DNA检测非常灵敏。GelGreen可配合蓝色可见光激光凝胶扫描仪或可见光激发的DarkReader使用,在预制凝胶和后染中均优于SybrGreen I,且不存在稳定性问题。两者均有较强稳定性,可长期室温保存,热稳定性极高,电泳缓冲液中可用微波炉加热不发生变性。预制凝胶可成批制备长期保存。与EB或SybrGreen I等其他核酸染料相比安全性得到极大提高,标准艾姆斯氏测试结果表明其特殊化学结构难以穿透细胞膜,保证了实验者安全。
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来源:源叶生物
北京